Mol Cancer | 成都中医药大学团队揭示肺腺癌肿瘤细胞异质性及其侵袭转移潜在机制
2024-12-03
中科新生命
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肺腺癌（LUAD）多伴有肺结节，其中毛玻璃结节（GGN）和部分实性结节（PSN）检出最多，伴有GGN特征的早期LUAD术后5年无病生存率接近100%。相比之下， PSN有更高的转移和疾病进展风险。这表明不同的结节特征与LUAD的恶性表型和疾病进展存在潜在的强相关性。2024年11月，来自成都中医药大学的由凤鸣、郑川研究团队在Molecular Cancer上发表题为“Single‑cell RNA sequencing reveals immune microenvironment niche transitions during the invasive and metastatic processes of ground‑glass nodules and part‑solid nodules in lung adenocarcinoma“的研究文章。该研究通过scRNA-seq揭示肿瘤细胞的异质性和复杂TME的细微差别，确定关键的肿瘤相关巨噬细胞TREM2 + TAMs和CXCL9 + TAMs 驱动肿瘤抑制或促进表型，并通过类器官和基因编辑技术揭示其潜在分化机制，深入表征了GGN-和PSN-LUAD进化轨迹的分子特征，具有重要的临床意义。
研究材料
8例GGN-和7例PSN-LUAD肿瘤组织，4例相邻正常组织
研究步骤
步骤1：scRNA-seq描绘GGN-LUAD和PSN-LUAD细胞图谱；
步骤2：阐明GGN-LUAD和PSN-LUAD组别的上皮细胞及内皮细胞异质性；
步骤3：髓系细胞肿瘤浸润特征；
步骤4：淋巴系细胞的肿瘤浸润特征；
步骤5：细胞互作揭示GGN-和PSN-LUAD肿瘤侵袭和转移模式差异；
步骤6：IFN-γ调节CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞间互作，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭转移的进展并在类器官模型中得到验证。
研究结果
1. GGN-和PSN-LUAD的单细胞景观
scRNA-seq共得到188,594个细胞，12个cluster，分别是T细胞、上皮细胞、B细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞、淋巴内皮细胞和平滑肌细胞。研究者对正常肺组织（NC组）、GGN-和PSN-LUAD组织中各种细胞类型组成的异质性进行了深入分析，发现与NC组不同，PSN-和GGN-LUAD组富集T细胞和B细胞，髓系细胞浸润减少。此外，随着GGN-和PSN-LUAD在侵袭和转移过程中发生变化，表明不同肿瘤进程中细胞组成的变化可能与疾病进展机制相关。
图1 GGN-LUAD和PSN-LUAD细胞景观
2. PSN-和GGN–LUAD进展过程中上皮细胞异质性
定义恶性上皮细胞和非恶性上皮细胞，发现恶性细胞表现出更强的谱系分化能力和更高的上皮-间质转化（EMT）特征。此外，PSN-LUAD组不同阶段的谱系分化能力和EMT普遍高于GGN-LUAD组，表明两组LUAD的恶性程度不同，且不同进展阶段上皮细胞转录存在异质性，可能与临床疾病进展相关。
3. 内皮细胞在PSN-和GGN-LUAD侵袭和转移过程中协调血管生成
缺少内皮细胞形成肿瘤缺氧环境，通过诱导代谢重编程进一步促进肿瘤细胞的转移。与正常组织相比，两组LUAD的TME中内皮细胞比例均显著降低。将内皮细胞群细分为6个亚群，发现尖端细胞在所有肿瘤样本中的比例均高于正常样本，并随疾病进展而逐渐提升占比，且分化能力更强，而其他主要肺内皮细胞亚型的比例变化不明显。该研究中，PSN-LUAD样本中尖端细胞的比例高于GGN-LUAD样本，这可能是PSN-LUAD临床侵袭和转移更快的潜在机制之一。
图2 GGN-LUAD和PSN-LUAD侵袭转移过程中上皮细胞和内皮细胞的表达模式
4. 髓系细胞分析揭示由CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs驱动的免疫微环境生态位转变
GGN-和PSN-LUAD中TREM2+、CXCL9+TAMs的比例高于正常样本，且TREM2 + TAMs在PSN-LUAD组比例较高，CXCL9 + TAMs在MLC期间显著减少，多重免疫荧光验证表明TREM2+和CXCL9+TAMs有潜在的拮抗关系。综上，CXCL9 + TAMs和TREM2 + TAMs的改变对LUAD的进展有显著影响，并且可能解释PSN-LUAD和GGN-LUAD之间不同的发展趋势。
图3 髓系细胞分析
5. 免疫微环境中淋巴细胞浸润特征
与NC相比，GGN-MIA、GGN-IAC和PSN-MIA阶段T细胞比例显著增加；GGN-和PSN-LUAD中CD4+ T细胞的浸润增加，且在IAC期最高。GGN-LUAD中B细胞的浸润在MIA-IAC期明显增加，在MLC期明显减少。在PSN-LUAD中，MIA期B细胞比例显著增加，IAC和MLC期B细胞比例显著减少。不同组间B细胞亚群比例无显著差异，说明以B细胞为主的免疫微环境的变化与组织中B细胞的整体浸润丰度有关。这些发现表明巨噬细胞和T细胞在GGN-和PSN-LUAD侵袭和转移过程中的免疫异质性中起主要作用。此外，该研究发现了RTM + TAMs、MMP19 + TAMs、CD4 + MT和CD4 + Tstr等新的细胞类型。
6. 细胞互作揭示GGN-和PSN-LUAD肿瘤侵袭和转移模式差异
细胞通讯分析揭示不同疾病阶段GGN-和PSN-LUAD免疫微环境的异质性，在GGN-LUAD的MIA阶段，活跃的免疫细胞主要是B细胞和T细胞。随着肿瘤浸润的进展，这些亚群与其他髓系细胞之间的信号传导强度逐渐增加。在MLC阶段，所有免疫细胞类型与B细胞和T细胞亚群之间的信号通信明显减弱，肿瘤免疫微环境中活跃的细胞类型向巨噬细胞亚群过渡。与GGN-LUAD相比，PSN-LUAD的这种转变发生得更早，可能反映了PSN-LUAD的进展更快。
图4 T细胞和B细胞的表达特征
7. IFN-γ调节CXCL9 + TAMs与CD8 + Trm细胞间互作，进而影响GGN-和PSN-LUAD侵袭转移的进展
研究人员发现IFN-γ、炎症反应和P53通路等在CXCL9 + TAMs中更为活跃；IFN-γ是一种重要的巨噬细胞激活剂，可增强肿瘤免疫浸润和炎症反应。与GGN-LUAD不同阶段相比，PSN-LUAD中IFN-γ信号通路活性较低，且仅由NK和CD8 + Trm细胞释放。这解释了在PSN-LUAD侵袭期，CXCL9 + TAMs与CD8 + Trm细胞之间的相互作用较GGN-LUAD减弱。进一步分析发现STAT1既能响应IFN-γ的诱导，又能调节下游CXCL9相关基因的表达，从而影响细胞的生长CXCL9 + TAMs的分化，且在CXCL9 + TAMs中高表达。本研究证实STAT1和CXCL9之间的调控关系。
图5 CXCL9 + TAMS、TREM2 + TAMs、IFN-γ通路相关分析
8. 体内验证IFN-γ/STAT1通路在LUAD发生和进展中的作用
通过类器官培养和CRISPR-Cas9基因编辑技术，在免疫功能正常的小鼠中构建原代和原位LUAD模型。构建WT、Trp53−/−和Trp53−/−；KrasG12D （TK）类器官，通过小鼠肿瘤组织的RNA-seq检测、Western blot和ELISA实验，验证scRNA-seq的结果，即随着LUAD的发生和进展，免疫细胞浸润逐渐减少，表明随着疾病的进展，免疫细胞衰竭发生在肿瘤微环境中。
图6 Trp53−/−;KrasG12D驱动产生肺腺癌
图7 通过肺类器官对小鼠不同阶段肺腺癌（LUAD）进行建模
结论
该研究证实了GGN-和PSN-LUAD的细胞组成和免疫应答存在显著异质性，并进一步揭示了CXCL9 + TAMs和TREM2 + TAMs及其调控基因在LUAD不同发展阶段的富集差异和相互作用模式。研究结果表明，IFN-γ通过激活STAT1信号和调节CXCL9 + TAMs与CD8 + Trm之间的相互作用，影响GGN-和PSN-LUAD的侵袭和转移。
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